，37℃培養(yǎng)3-5天再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)14-24h
。吸出DEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,2m1/L,再培養(yǎng)24-48h。用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞
，以備分析鑒定
3
、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：
●……接種細(xì)胞同前述，細(xì)胞長(zhǎng)至50%
●……DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前
。
●……在每孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,37℃培養(yǎng)48h
。
●……吸出DEM,用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間篩選轉(zhuǎn)染克隆
，方法參照細(xì)胞克隆篩選法進(jìn)行
。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)總述
一、細(xì)胞轉(zhuǎn)染途徑
轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)
、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑
。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于物理介導(dǎo)技術(shù)
；化學(xué)介導(dǎo)方法很多
，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀；
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法
、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)
；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染
，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)
1
、物理介導(dǎo)
1）電穿孔法：靠脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞
優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率較高
缺點(diǎn)：需要昂貴的儀器(電穿孔儀)；對(duì)細(xì)胞的損傷較大
，每次轉(zhuǎn)染需要
更多的細(xì)胞和DNA;每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化
2)顯微注射：借助顯微注射器直接把DNA注入核內(nèi)
，使之整合入受體細(xì)胞基因組中
優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率高，可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染
缺點(diǎn)：導(dǎo)入DNA時(shí)需要一個(gè)細(xì)胞一個(gè)細(xì)胞注射
，不適合大量轉(zhuǎn)染
3)基因槍：依賴攜帶了核酸的高速粒子將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)2
、化學(xué)介導(dǎo)
2、化學(xué)介導(dǎo)
(1)磷酸鈣共沉淀法
磷酸鈣有利于促進(jìn)外源DNA與靶細(xì)胞表面結(jié)合
，氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按定的比例混和
，形成極小的磷酸鈣-DNA復(fù)合物沉淀黏附在細(xì)胞膜表面，借助內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)
。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對(duì)于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要
。
優(yōu)點(diǎn):能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動(dòng)物
，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
缺點(diǎn):轉(zhuǎn)染效率低:進(jìn)入細(xì)胞的DNA只有1 %- 5 %可以進(jìn)入細(xì)胞核
，其中只有不到1%的DNA可以與細(xì)胞DNA整合,在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)
。重復(fù)性不佳:pH值、鈣離子濃度
、DNA濃度
、沉淀反應(yīng)時(shí)間、細(xì)胞孵育時(shí)間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響
。
(2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法
中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA
，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽離子脂質(zhì)體
，DNA 并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中
，而是帶負(fù)電的 DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物
，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面
，經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。
優(yōu)點(diǎn):適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞
，可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染;轉(zhuǎn)染效率高
，比磷酸鈣法高5-100倍;能夠把DN A和R N A轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性好
，可重復(fù)性高
，轉(zhuǎn)染時(shí)盡量不加血清和抗生素。
缺點(diǎn):陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性相對(duì)較高
，對(duì)部分細(xì)胞可能會(huì)干擾細(xì)胞的代謝
。
(3)多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)
DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，其原理還不清楚
，可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，此法只適合暫時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
，轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡 聚糖濃度以及細(xì)胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時(shí)間的長(zhǎng)短很有關(guān)系
，可采用較高濃度的細(xì)胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時(shí)間的長(zhǎng)短很有關(guān)系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時(shí)間(30 分鐘-1.5小時(shí)),也可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長(zhǎng)時(shí)間(8小時(shí))
。
3
、生物介導(dǎo)
病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染:以病毒作為載體,通過病毒感染的方式將外源DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中，其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)zui為常用
。
優(yōu)點(diǎn):整和效率高
，可使外源基因在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)，適用于難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞
。
缺點(diǎn):存在潛在的安全危險(xiǎn)性
。
二
、理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法
理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高
、細(xì)胞毒性小
、重復(fù)性好、安全
、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)
。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率zui高的方法
，同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢(shì)
。但是，病毒轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜
，常常對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性
，在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法
，則各有其特點(diǎn)
。
三細(xì)胞轉(zhuǎn)染分類
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染:是指外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，存在于游離的載體.上
，不整合到細(xì)胞的染色體上
。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染: DNA 整合到宿主細(xì)胞的染色體中。
四
、報(bào)告基因
是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因
，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因
，或與其它目的基因相融合
，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控
。
常用的報(bào)告基因系統(tǒng):半乳糖苷酶報(bào)告系統(tǒng)
、素酶報(bào)告系統(tǒng)、蛋白報(bào)告系統(tǒng)(GFP)等
。
五
、轉(zhuǎn)染方法
本人用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉(zhuǎn)染單層貼壁細(xì)胞。( 別的方法可以參考生產(chǎn)商提供的protocol)
1
、轉(zhuǎn)染前1天將0.5~2X105細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板
，并加入500ul不含抗生素的*培養(yǎng)基，以保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合達(dá)90~95%
。
2
、準(zhǔn)備復(fù)合物
(1)將0.8ugDNA稀釋于50ul無血清無抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。
(2)將 2ul Lipofectamine2000 稀釋于50u1無血清無抗生素的培養(yǎng)液中
，輕輕渾勻
，室溫孵育5分
。注意:必須在25分內(nèi)進(jìn)行。
(3) 5 分后將它們混合
，并輕輕渾勻
，室溫孵育20分。
3
、吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基
，用PBS或無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次。4
、將復(fù)合物(總體積100u1)加入培養(yǎng)孔
，前后搖動(dòng)培養(yǎng)板使其分布均勻。.
5
、將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱孵育4~6h后
，可以更換含血清培養(yǎng)液去除復(fù)合物(也可不用)。
6
、24~ 48h后可以觀察轉(zhuǎn)入基因表達(dá)情況
。
7、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染:換含血清培養(yǎng)基24h后將細(xì)胞以1: 10 (或更高比例)傳代
，1天后更換篩選培養(yǎng)基篩選
。
8、優(yōu)化:要保證細(xì)胞匯合率達(dá)90~95% (比較高) ; DNA/ Lipofectamine2000比率1: 0.5~1: 5
，一般細(xì)胞1: 2~3.
本文文章來源：百度文庫《脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟脂質(zhì)體(LR)試劑是陽離子脂質(zhì)體DOTMA和DOPE》作者：淘氣的小孩00
AVT為大家?guī)韼卓钚滦妥⑸浼?jí)陽離子脂質(zhì)材料
，包括Dlin-MC3-DMA、DMG-PEG2000
15692161719
聯(lián)系方式
15692161719
86-21-58876118
